——声明：仅供医疗专业人士参考
编者按：目前分子靶向治疗已成为晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的首选治疗方式，极大地提高了疾病的疗效和患者的预后。然而，由于肿瘤细胞的克隆进化机制，靶向药物在特定治疗周期后出现耐药，疗效受到限制。对于药物治疗反应的传统评估方式是影像学，并不能反映分子水平上的克隆进化。由肿瘤细胞凋亡和坏死释放至外周血的循环肿瘤DNA(ctDNA)，已经被证明能够反映肿瘤样本的分子特征，逐渐被接受成为检测NSCLC突变的替代手段。为此，智慧病医院病理科祝峙博士来谈谈通过ctDNA突变分析肿瘤克隆进化关系。
祝峙/博士，主任医师
医院病理科中华医学会病理学分会脑神经专业组委员中国医师协会病理专业委员会青年委员上海市预防医学会环境病理专业委员会副主任委员上海市医学会呼吸病分会烟草病与肺结构病学组副组长上海市医学会病理专科分会委员上海市医师协会病理专业委员会委员海*医院病理科主任肺癌治疗的优化之路--通过循环肿瘤DNA(ctDNA)突变分析肿瘤克隆进化关系
克隆进化模型认为，肿瘤最早起源于单个发生了关键突变的细胞，随着肿瘤细胞的生长分裂，它会获得新的突变，这些突变使肿瘤产生了不同的亚克隆，并且这些不同的亚克隆具有分裂和再一次发生突变的能力，在肿瘤微环境选择作用下，具有生长优势的克隆被选择出来，并逐渐成为主效克隆。克隆进化是非小细胞肺癌（NSCLC）靶向药物耐药的重要机制。随着二代测序(NGS)平台以及包括循环肿瘤DNA（ctDNA）在内的液体活检技术的发展，促进了我们对NSCLC不同治疗阶段的突变情况及肿瘤的克隆进化的监测[1]。
1.肺癌克隆进化和耐药
◇1.1EGFR突变阳性的NSCLC的克隆进化和耐药
EGFR突变（如19外显子缺失或LR突变）的NSCLC，可在药物治疗后甚至治疗前产生耐药性（图1）。在第一种情况下，暴露于EGFR-TKI（如吉非替尼或厄洛替尼）后，肿瘤通过激活旁路途径（MET或HER2扩增等信号通路）而产生耐药。同时，在EGFR-TKI的作用下，肿瘤因其基因的不稳定性而发生二次突变（如TM）。在第二种情况，肿瘤在药物治疗前就包含少量的TM突变群体。经药物治疗后，耐药细胞占绝大多数肿瘤。很难在每个肿瘤中诊断出二次突变（TM）是否在药物治疗之前就已经存在。在这两种情况下，肿瘤随后接受了针对第二次或第三次突变的药物治疗，产生耐药性，表现为具有第三或第四次突变[2]。
图1EGFR突变阳性NSCLC的克隆进化和耐药
◇1.2EML4-ALK融合的NSCLC的克隆进化和耐药
与EGFR-TKI耐药相似，EML4-ALK融合的NSCLC对ALK-TKI有两种主要的耐药机制。一种是由于在克唑替尼crizonib治疗后的二次突变（如LM），在进一步使用第二代ALK-TKI色瑞替尼certinib或阿来替尼Alectinib治疗后，又发生了第三次突变。另一种方式是在ALK-TKI的作用下，补偿性地引起了EGFR通路的激活（图2）[2]。
图2EML4-ALK融合NSCLC的克隆进化和耐药
2.ctDNA突变检测分析克隆进化
◇2.1ctDNA突变检测分析克隆进化的优势
肿瘤克隆进化与疾病复发相关研究用以下模式图（图3）描述了亚克隆的早期分化与疾病复发的关系。在肿瘤切除之前，克隆A（*色）是占优势的克隆。亚克隆A-i（蓝色）是克隆a的嵌套后代。克隆B（绿色）是一个小克隆，最早从克隆A中进化而来，克隆B在切除的样本中数量最少，几乎检测不到，却作为主要克隆导致疾病的临床复发。
图3复发性疾病的早期克隆分化模式图
由于以上情况的存在，仅根据组织样本的分子病理检测结果难以监测肿瘤的克隆进化。ctDNA检测能够在一定程度上弥补组织活检的难以重复检测和抽样偏差的特点。多项类似研究显示，在患者ctDNA样本中发现相应的组织样本中没有检测出的各类突变，说明ctDNA的取样更具代表性。ctDNA可重复取样的特点也便于在肿瘤治疗周期中多点取样，对治疗反应进行实时监测[3]。
◇2.2ctDNA突变检测分析克隆进化相关研究
一项关于通过ctDNA纵向监测NSCLC患者EGFR-TKI治疗期间细胞变异的前瞻性研究，用NGS方法检测了NSCLC患者血浆ctDNA样本在治疗前的基线突变情况及疾病进展后的突变情况。可以看出，在治疗前后多个驱动基因的突变率发生了变化，如EGFR激活突变从初始状态的58%减少至47.4%，而耐药突变TM从4.1%增加至22.8%。此外，疾病进展后还出现了基线状态下没有检测到的KRAS、NRAS、PIK3CA、PTEN突变及FGFR3扩增（表1）[4]。
表1通过NGS检测的ctDNA中的基线和疾病进展后的突变情况，n（%）
对于使用PD-1抑制剂进行免疫治疗的NSCLC患者，如何确定患者的治疗反应和预测潜在复发风险仍然是一个挑战。一项采用个泛癌相关基因的NGSpanel对治疗前和治疗后的NSCLC患者血浆ctDNA进行检测的研究结果显示，基线血液肿瘤突变负荷(bTMB)水平高的患者在pembrolizumab治疗后PFS明显延长。肿瘤负荷与治疗反应与最大体细胞等位基因频率(maximumsomaticallelefrequency,MSAF)显著相关，而与bTMB无关。ctDNA克隆进化分析比CT扫描大约提前2~4个月检测到肿瘤进展[5]。
3.克隆进化导致耐药的针对性治疗策略
◇3.1适应性治疗
适应性治疗（AdaptiveTherapy）是一种基于癌症基因组进化的治疗策略。当肿瘤因化疗而开始缩小时，减少药物剂量。使对化疗敏感的细胞被允许保持在一定的水平并与耐药细胞竞争，阻止肿瘤生长（图4）。在标准的临床实践中，肿瘤治疗的目标是最大限度地减少肿瘤负荷，而治疗过程中耐药细胞群体的出现经常导致治疗的失败。适应性治疗的重点是通过稳定肿瘤大小来延长进展时间。适应性治疗需要在两个不同的阶段改变药物的剂量和疗程：（1）诱导阶段：在此期间肿瘤缓慢进展；（2）维持阶段：该阶段需要逐步降低剂量甚至间歇性暂停用药。该疗法相比固定剂量用药能达到更好的PFS，而控制用药量的时机应根据敏感和耐药癌细胞之间的平衡来决定[6]。
图4适应性治疗（绿色：药物敏感细胞；红色：耐药细胞）
◇3.2重塑肿瘤进化
一个更困难但有趣的治疗模式是积极地塑造肿瘤基因组，通过初始药物将肿瘤的异质性降低到可预测的状态，然后再被二级药物靶向(图5)。例如ALK融合的NSCLC，由于CY突变，患者在使用克唑替尼治疗后出现疾病进展，但对第三代ALK-TKI劳拉替尼有反应。复发时，该患者被发现有额外的ALK突变(LF)导致了劳拉替尼耐药性，但却恢复了克唑替尼的敏感性[6]。
图5通过重塑肿瘤进化治疗靶向肿瘤内异质性
(A)肿瘤初始诊断时具有高度的肿瘤内异质性，自由进展的情况下将发展成为具有多个代表性的亚克隆群体（不同颜色代表不同的基因组变异类型的亚克隆）。(B)重塑肿瘤进化。利用克隆进化原理，通过特定治疗，在药物筛选压力下不同基因组变异类型的亚克隆转化为相同的变异类型（深蓝色），随后使用针对性的二级药物靶向转化后的肿瘤。
如何利用肿瘤的克隆进化原理，通过合理的药物设计以塑造肿瘤的进化乃至最终攻克肿瘤，以上这些治疗策略的相关研究给我们提供了新的思路。同时，进一步发展包括ctDNA等高灵敏度的液体活检技术，来更好地观察和检测克隆成分的实时变化也是非常重要的。
参考文献：
[1]ShinjiKohsaka,MarkPetronczki,FlavioSolcaet.al,TumorclonalityandresistancemechanismsinEGFRmutation-positivenon-small-celllungcancer:implicationsfortherapeuticsequencing,FutureOncol,Feb;15(6):-.
[2]YingjiaoXue,ShendaHou,HongbinJi,et.al,Evolutionfromgeneticstophenotype:reinterpretationofNSCLCplasticity,heterogeneity,anddrugresistance,ProteinCell,Mar;8(3):-.
[3]RebeccaABurrell,CharlesSwanton，Re-EvaluatingClonalDominanceinCancerEvolution,TrendsCancer,May;2(5):-.
[4]EijiIwama,KazukoSakai,NorikoHidaka,et.al,Longitudinalmonitoringofsomaticgeneticalterationsincirculatingcell-freeDNAduringtreatmentwithepidermalgrowthfactorreceptor-tyrosinekinaseinhibitors,Cancer.Jan1;(1):-.
[5]LiLi,YuboWang,WeiweiShi,et.al,Serialultra-deepsequencingofcirculatingtumorDNArevealstheclonalevolutioninnon-smallcelllungcancerpatientstreatedwithanti-PD1immunotherapy,CancerMed.Dec;8(18):-.
[6]TaichiroGoto,YosukeHirotsu,KenjiAmemiya,et.al,UnderstandingIntratumorHeterogeneityandEvolutioninNSCLCandPotentialNewTherapeuticApproach,Cancers(Basel).Jun22;10(7):.
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