前言
肿瘤免疫治疗是通过人体免疫系统恢复或增强对肿瘤的自然防御的一种治疗方法。这种治疗通常针对癌细胞表面的特定生物分子，如肿瘤相关抗原（TAAs）。抗肿瘤活性是通过将宿主免疫系统导向TAAs来实现的，从而建立或诱导针对癌细胞的适应性免疫反应。在过去的几十年里，利用单克隆抗体（Mab）治疗癌症取得了巨大的成功，其中许多已经被批准用于癌症治疗或临床试验。
4-BB（CD37/TNFRSF9）于年被鉴定为一种诱导基因，在抗原启动的T细胞上表达，而在静止的T细胞上不表达。此外，已知其在树突状细胞（DC）、自然杀伤细胞（NKs）、活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤T细胞（NKT）和肥大细胞中表达，但骨髓源性抑制细胞（MDSCs）在其表面不表达该分子。抗4-BB抗体具有激活细胞*性T细胞和增加γ干扰素（IFN-γ）生成的能力，在抗癌方面显示出巨大的潜力。
4-BB的分子特性
肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）是一个由29个成员组成的蛋白质超家族，在人类免疫系统中发挥着重要作用。这个分子家族分为两类：死亡受体（8个成员）和激活受体。它们都含有一个细胞内信号通路激活域和一个细胞外受体位点。这些受体位点可通过与肿瘤坏死因子超家族（TNFSF）的相应配体结合来激活。已有研究表明，TNFSF-TNFRSF的配体受体（如CD40-CD40L、CD27-CD70或OX40-OX40L）信号通路可以调节体内许多重要的过程，如细胞的发育和死亡，细胞因子和趋化因子的诱导。越来越多的证据表明，TNFRSF和TNFSF成员参与了包括癌症在内的多种疾病的炎症和病理学。因此，针对TNFSF和TNFRSF配体-受体相互作用的免疫治疗技术在癌症治疗中具有很高的潜力。
在免疫治疗中，有效的免疫反应需要两种生物信号来充分激活T细胞和其他免疫细胞。第一种信号即抗原特异性信号，是由淋巴细胞受体与抗原呈递细胞（APCs）上主要组织相容性复合体（MHC）分子结合的特异性肽相互作用而产生的。第二种是非抗原特异性的共刺激信号。这种类型的信号是通过T细胞和APCs上表达的共刺激分子之间的相互作用提供的。4-BB是一种共刺激分子，属于TNFRSF。它是在80年代末进行T细胞因子筛选时，对小鼠辅助T细胞和细胞*性T细胞用刀豆球蛋白A刺激发现的。人4-BBL于年首次通过直接表达克隆从活化的CD4+T淋巴细胞群中分离出来。4-BBL主要在树突状细胞、B细胞或巨噬细胞上表达。
在小鼠中，4-BB/4-BBL激活导致TNFR因子（TRAF和TRAF2）的募集，从而导致活化B细胞的NF-κB、JNK/SAPK和p38MAPK通路的激活。这会产生共刺激信号来诱导CD4+和CD8+T淋巴细胞的活性，其中对CD8+T细胞的增殖更有利。通过p38MAPK激活CD4+T淋巴细胞对于辅助性T细胞（Th）和2的发育以及Th效应细胞的调节也是必不可少的。试验证明，4-BB的激动剂单克隆抗体可向CD8+T淋巴细胞提供长期存活信号，从而抑制活化诱导的细胞死亡（AICD）。4-BB/4-BBL通路也影响免疫系统中的非T细胞，包括通过放大单核细胞介导的恒定自然杀伤T细胞（iNKT)的增殖来控制单核细胞数量。4-BB和/或4-BBL激动剂可刺激脂肪细胞和巨噬细胞产生多种炎症细胞因子，如IL-6、TNF-α和MCP-。B细胞上4-BB交联产生共刺激信号，激活并诱导B细胞增殖。
4-BB激动剂抗体在动物模型中的抗肿瘤作用
抗4-BB激动剂单抗已被证明在几种癌症模型中诱导和提高抗癌免疫能力。这种抗体抑制肿瘤的机制是它对调节机体对癌细胞免疫反应的关键免疫细胞的作用。抗4-BB抗体刺激并激活效应T淋巴细胞（例如，刺激CD8+T淋巴细胞产生INFγ）、NKT和APCs（例如巨噬细胞）选择性地杀死癌细胞。在抗4-BB单抗的刺激下，肿瘤抗原特异性记忆T细胞的数量和活性也增加，从而延长了对癌细胞的免疫反应。包括4-BB在内的几种TNF受体主要作为T细胞活化的共刺激因子发挥作用。此外，共刺激4-BB可通过调节细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖激酶激活Akt促进细胞周期。然而，这种抗体对NK细胞的作用仍然存在争议：这种抗体激活小鼠NK细胞，而对于人类NK细胞即可以激活也可以抑制，取决于条件和模型。另一方面，这种抗体抑制免疫抑制细胞的增殖和活性，如MDSCs和调节性T细胞。另据报道，抗4-BB抗体可阻断IL-9的产生以抑制T调节细胞。
抗4-BB抗体对肿瘤免疫的影响是通过4-BB受体对肿瘤微环境中的免疫细胞、癌细胞和其他细胞的共刺激。因此，需要在靶细胞和宿主细胞上表达4-BB，而对肿瘤细胞或宿主细胞（抗原特异性记忆T细胞和来自造血和非造血来源的细胞）的4-BB基因敲除可消除该抗体的抗肿瘤作用。肿瘤相关内皮细胞表面4-BB的特异性存在增加了活化T细胞向恶性组织的迁移。此外，抗4-BB单抗诱导的淋巴瘤排斥反应需要穿孔素颗粒酶和FAS-L机制的细胞溶解协同作用。
激动剂抗4-BB抗体增强抗肿瘤免疫，保护小鼠免受肝癌侵袭。这种结果是由于这种抗体对细胞*性T细胞、NK细胞和巨噬细胞的激活作用。此外，该抗体还会限制抑制抗肿瘤免疫的细胞（如MDSC和调节性T淋巴细胞）的浸润。在小鼠恶性黑色素瘤模型中，抗4-BB抗体通过扩增抗原特异性记忆T淋巴细胞来防止原发性肿瘤切除后癌症的复发和转移。在小鼠中，抗4-BB单抗可有效预防淋巴瘤，如诱导肿瘤大小缩小和生存率增加，因为它增强NKs和CD8+淋巴细胞的功能，而抑制调节性T细胞。值得注意的是，这种抗体模拟的抗淋巴瘤免疫是持久的。抗4-BB单克隆抗体的这些抗肿瘤活性也在小鼠肺癌（M09）和乳腺癌（EMT6）模型中观察到。用抗4-BB抗体（BMS-）治疗可以适度地使M09肿瘤的生长减慢，但可以显著地阻止EMT6肿瘤的发展，尤其是在联合放疗的情况下。
4-BB激动剂抗体的单药治疗
4-BB抗体在动物体内预防癌症的效果促进了临床的开发。在一项临床前研究中，一种与4-BB胞外域结合的人IgG2，即PF-，可以有效地防止异种移植人类癌症模型的进展。这种抗4-BB抗体激活NF-κB，诱导人和猴白细胞产生下游细胞因子，并促进猴CD8+T细胞增殖。抗4-BB单抗已被考虑用于晚期癌症患者的临床试验，但由于4-BB受体上抗4-BB抗体结合位点的物种间差异，其抗癌能力应该是多变的。具体地说，它的结合作用仅限于富含半胱氨酸结构域（CRD），并且在小鼠和人之间存在差异。小鼠4-BBL主要与CRDII结合，人4-BBL主要与CRDIII结合。简言之，人和小鼠的4-BBCRD有四个CRD（CRDI，II，III和IV）。CRDI和CRDIV区都只含有4种半胱氨酸，不能形成典型的CRD结构，而CRDII和CRDII都含有6种半胱氨酸，可以形成典型的CRD结构。
目前，针对两种抗4-BB单克隆抗体，即urelumab（BMS-）和utomilumab（PF-）正在进行两项临床试验。它们是分别由百时美施贵宝和辉瑞公司开发。在一项临床前研究中，Urelumab显示了一种很有前途的癌症治疗潜力。然而，抗体的肝脏*性在随后不久出现，这导致了年2月至年2月期间，urelumab开发计划被搁置。这种*性主要是由于肿瘤和基质细胞分泌的S00A4蛋白所致。最近的研究表明，每3周每名患者注射8毫克或0.毫克/千克的抗体是安全的。
与urelumab相比，utomilumab在27名癌症患者队列中没有观察到剂量限制性*性（DLT）或肝酶升高。最近，utomilumab治疗55例晚期癌症患者的I期试验结果出来了。试验数据支持了utomilumab耐受性良好的安全性，每4周在0mg/kg的剂量水平下未观察到DLT。除此之外，大多数患者出现级或2级以下的不良事件。实体瘤患者总客观响应率为3.8%，最佳总有效率为24.5%，其中完全缓解例。在临床环境下，urelumab或utomilumab的*性差异的机制已经比较清楚，这可能是由于它们的激动剂活性或4-BB结合特性的机制差异所致。utomilumab和urelumab结合受体结构的比较表明，单抗在表位和相对取向上具有明显不同的结合位点。utomilumab沿着4-BB侧结合，在CRDIII和IV的交界处接触。相比之下，urelumab结合在CRDI上4-BB受体的N端。使用剂量减少的Ureumab单药治疗的临床疗效结果基本无效，并且在耐受剂量下，Urelumab的临床活性有限。虽然有报道称，utomilumab具有更好的安全性，但相对于urelumab，它是一种药效较弱的4-BB激动剂。由于其较好的安全性，与urelumab相比，utomilumab是联合治疗的首选单抗。
在血液肿瘤中，抗4-BB抗体的单一免疫治疗在某些模型中可以调节血液恶性肿瘤。在多发性骨髓瘤小鼠模型中，与对照组相比，该抗体可挽救治疗组40-50%的小鼠。抗4-BB单抗还抑制了50%实验动物的急性髓系白血病（AML）的生长。抗4-BB单克隆抗体的这些抗血液肿瘤的结果是由于CD8+T细胞和IFN-γ的增加。
4-BB抗体与其它抗体的联合治疗
在几种癌症模型中，抗4-BB受体的特异性抗体与其他抗体在抑制肿瘤方面具有协同作用。在这些联合疗法中，抗体相互支持，以实现相对于单一治疗对癌症的更高的免疫反应。
调节性T淋巴细胞、吲哚胺-2,3-双加氧酶（IDO）+DCs或T细胞以及粘蛋白结构域3（TIM-3）等调节性屏障可抑制免疫系统对致癌抗原的免疫反应。这就解释了为什么在抗4-BB单克隆抗体试验中，监管屏障的缺失成为提高对癌症的免疫反应的目标。抗4-BB单抗与西妥昔单抗（Cetuximab）联合用药可增强西妥昔单抗的抗肿瘤作用。西妥昔单抗上调患者NK细胞4-BB的表达，这种共刺激分子的表达诱导NK细胞和记忆T细胞活化。而抗4-BB单克隆抗体则通过激活4-BB受体来提高NK细胞脱颗粒和细胞*性，从而增强抗癌免疫能力。S00A4是一种钙结合蛋白，在炎症反应和肝脏发病机制中具有重要作用。如前所述，抗4-BB单抗主要通过S00A4分泌引起肝*性。抗4-BB和抗S00A4单克隆抗体的联合免疫治疗比抗4-BB单抗治疗显示出更强的抗肿瘤反应，并且显著降低了小鼠模型的肝脏病理学改变。
程序性死亡受体-（PD-）提供抑制信号，维持T淋巴细胞对同源抗原的功能沉默；因此，其特异性抗体干扰PD可导致T细胞活化，并在PD-阻断和抗4-BB抗体联合治疗下增强抗肿瘤免疫能力。用抗PD或抗4-BB单抗单药治疗小鼠模型中超过第7天的肺癌是无效的，而这两种抗体的组合显示出完全的肿瘤排斥反应。通过连续给药抗4-BB和抗PD单抗而不是单用治疗小鼠B细胞淋巴瘤，获得了更高的疗效增强，协同治疗依赖于Fc受体。单抗抗肿瘤活性的主要机制是Abs依赖性细胞介导的细胞*性（ADCC）。ADCC使携带Fc受体（CD6）的NK细胞与抗体靶向的肿瘤细胞结合并促进肿瘤细胞溶解。在B6黑色素瘤荷瘤小鼠中也观察到了同样的观察结果，抗4-BB/抗PD-组合比抗4-BB、-PD、-CTLA-4或-CD4的单抗治疗更有效地减少癌症的发生。
在临床前试验中，抗4-BB单克隆抗体与抗PD、-CTLA-4或-CD4抗体的联合免疫疗法对某些癌症药物产生了积极效果，但对其他一些癌症却没有效果，例如在B细胞淋巴瘤小鼠模型中联合抗4-BB和抗PD抗体。特异性抗体阻断PD蛋白支持抗4-BB单抗治疗小鼠卵巢癌和肺癌。抗4-BB和抗PD单抗的混合疗法通过诱导CD8+淋巴细胞的系统反应和免疫记忆来提高荷瘤小鼠的存活率。抗4-BB和抗CD40抗体的联合治疗可导致结肠癌和淋巴瘤荷瘤小鼠的肿瘤消退和生存期延长，但这种联合治疗在预防多发性淋巴瘤方面的作用不大。通过特异性抗体清除CD4+T细胞或阻断TIM-3使抗4-BB单抗的抗癌作用更为有利。抗CD4抗体去除调节性淋巴细胞和IDO+DC细胞，增强免疫细胞向肿瘤组织的浸润。因此，混合注射抗CD4和抗4-BB抗体可使荷黑色素瘤小鼠的癌症明显消退。此外，联合抗TIM-3治疗和4-BB激活不仅抑制调节性T细胞和激活CD8+淋巴细胞，而且还通过促进记忆性CD4淋巴细胞和减少免疫系统中的MDSC，对ID8卵巢癌提供更强的免疫应答。
通过抗体阻断细胞*性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）和CLTA-4配体之间的相互作用可提高整体免疫反应，通过混合注射抗4-BB和-CTLA-4抗体可以显著缓解结肠癌和黑色素瘤。这种联合策略通过抗原特异性增强CD8+T细胞活性和免疫记忆来提高抗癌免疫，但是也会通过增加调节性T淋巴细胞的功能而抑制自身免疫。进一步的研究表明，抗CTLA-4和抗4-BB抗体的联合免疫治疗仅在肿瘤特异性T细胞尚未耗尽的情况下有效。
抗4-BB单克隆抗体在癌症治疗中也显示了三重结合联用的益处。抗-PD和-CTLA-4抗体对抗免疫抑制性Th2，以支持抗4-BB单抗逆转已建立的肿瘤，这些抗体的抗肿瘤活性通过放疗增强。与抗OX40和抗PD-L抗体联用，抗4-BB抗体通过增加效应T淋巴细胞来预防小鼠肝细胞癌。在小鼠CT26肿瘤模型中，抗4-BB单抗与特异性抗体阻断PD-L/B7-H具有协同作用。这种抗体组合的抗肿瘤作用通过肿瘤微环境中的T细胞中的HIF-α低氧反应而增强。值得注意的是，低剂量的抗4-BB单抗可产生抗肿瘤的免疫反应，而不会产生任何副作用（例如肝脏炎症）。最近，抗4-BB、-CTLA4和-OX40单克隆抗体的低剂量（各0μg）三重组合对小鼠模型中的大肠癌和B细胞淋巴瘤有效。相反，最近的研究表明，抗4-BB与抗PD单抗抑制Eμ-myc转基因小鼠B细胞淋巴瘤的治疗潜力降低。
在乳腺肿瘤的异种移植模型中，抗4-BB单抗增加了曲妥珠单抗的抗癌作用。在这一组合中，曲妥珠单抗刺激NK细胞活性并增强4-BB在这些细胞中的表达，然后抗4-BB单抗提高了曲妥珠单抗调节的NK细胞*性和细胞因子释放，从而杀死肿瘤细胞。抗4-BB单抗还支持曲妥珠单抗治疗小鼠乳腺癌。utomilumab联合pembrolizumab（一种抗PD抗体）治疗23例晚期实体瘤患者的Ib期临床试验报告有26.%的应答（完全或部分应答），没有DLTs；在应答患者中观察到效应/记忆CD8+淋巴细胞水平升高。这些发现提示通过抗4-BB单抗与其他抗体的联合治疗可能让更多的癌症治疗获益。
4-BB抗体与其它方法的联合治疗
抗4-BB受体的单抗对免疫原性差的肿瘤细胞（弱肿瘤抗原）无抗癌作用，如B6-F0黑色素瘤、3-甲基胆蒽诱导的纤维肉瘤和TC-肺癌。因此，将抗4-BB抗体与其他试剂结合是必要的。
一种携带mIL-2（ADV/IL-2）的腺病*已被开发并被证明支持抗4-BB单抗对抗B6-F0肿瘤细胞引起的皮下和肺转移性黑色素瘤。这种重组病*诱导的IL-2刺激NK细胞激活免疫系统，导致CD8+T淋巴细胞募集到肿瘤微环境中，而抗4-BB的抗体则增加了这些招募的T细胞的功能。全身注射这种抗体可提高分泌IL-2的DC治疗结肠癌的根除效果。IL-2还支持抗4-BB单抗治疗肝癌；ADV/IL-2和抗4-BB特异性抗体的联合治疗通过增加NK和CD8+T淋巴细胞的功能，有效地排斥肝内发生的转移性肠癌。SFV-IL-2（编码IL-2的semlikiForest病*）和抗4-BB抗体的组合提供了强大的协同作用，以预防小鼠黑色素瘤和肺癌。瘤内注射这种产生IF-2的病*可诱导肿瘤区浸润的CD8+T淋巴细胞产生高水平的4-BB，这为单抗的抗癌活性提供了更多的选择性靶点。
4-BB抗体增强了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分泌细胞的活性以治疗癌症，GM-CSF分泌细胞疗法和抗4-BB单抗的联合治疗通过维持肿瘤浸润性CD8+T淋巴细胞的活化，使已建立的B6黑色素瘤得到显著消除，以及肿瘤微环境中记忆淋巴细胞的扩张。注射抗4-BB单抗修复了5-氟尿嘧啶（5-FU）抑制肾癌的局限性。抗4-BB单抗和5-FU联合治疗可通过增加效应淋巴细胞的浸润有效阻断70%以上的荷瘤小鼠。
将抗4-BB单抗与肿瘤裂解物刺激树突状细胞（TP-DC）疫苗联合治疗小鼠已建立的肺癌和皮下癌模型也获得了相同的结果。TP-DC疫苗可上调疫苗启动淋巴结（VPLN）内NK细胞上4-BB的表达，抗4-BB单克隆抗体可刺激VPLN和脾脏中型T效应细胞的抗癌活性，这一点在这些部位表现为高水平的干扰素γ。抗4-BB单抗抗肿瘤免疫的疫苗治疗应用的另一个例子是溶瘤痘苗病*（Vvdd）的工程株：该抗体与Vvdd的合作成功地抑制了已建立的皮下肿瘤，而Vvdd或抗4-BB抗体单独治疗对这些肿瘤模型仅有轻微影响。注射表达抗HVEM单链抗体的癌症疫苗（α-HVEM单链抗体疫苗）可通过CD8+T细胞和记忆T细胞的发育和活性来激活预防小鼠模型中的肥大细胞瘤和淋巴瘤的免疫反应。注射抗4-BB抗体可显著提高α-HVEM单链抗体疫苗的抗肿瘤活性。
抗4-BB抗体的抗血液学肿瘤作用可通过其他疗法增强。这种抗体与α-半乳糖基神经酰胺的肿瘤细胞疫苗接种相结合，使小鼠急性髓系白血病（ALM）模型的保护率比单独抗4-BB治疗提高00%。当抗4-BB抗体与靶向NKT细胞的疫苗一起注射时，也发现了类似的结果，这种结合在B细胞淋巴瘤小鼠模型中的长期存活率为50-70%。抗4-BB抗体的两项临床试验，utomilumab和urelumab，在与其他免疫疗法联合治疗淋巴瘤患者时，都显示了富有前景的结果。
有证据表明，在某些组合中，天然免疫也参与抗4-BB抗体的抗癌作用，特别是在治疗血液肿瘤方面。已经证明，这种抗体对癌细胞的作用是依赖于NK细胞的，特别是通过增殖和IFN-γ的分泌，以及这些固有淋巴细胞的细胞*性作用。
4-BB靶向药物的开发
BMS的4-BB抗体药物Urelumab（BMS-）是第一个进入临床试验的靶向4-BB治疗药物，其是一种IgG4单克隆抗体。Urelumab最初的临床结果发表于年，有着令人鼓舞的疗效。但Phase和Phase2阶段的数据显示出肝脏*性，并且似乎与药物靶标和剂量有关，因此临床开发受到了阻碍。Urelumab于年重新进入临床试验，目前正在进行研究Urelumab联合其他药物共同治疗胶质母细胞瘤、胰腺癌等实体瘤的潜力。
Utomilumab（PF-）是辉瑞开发的4-BB人源化IgG2单克隆抗体，相对于Urelumab，其具有更高的安全性，目前也正在进行多项临床试验中。除了以上两个，还有一些公司布局该领域，包括双特异性抗体，比如BioNTech，Aptevo等。年6月，BioNTech宣布已开始使用DuoBody-PD-Lx4-BB进行首次人体I/IIa期研究，DuoBody-PD-Lx4-BB是与GenmabA/S联合开发的双特异性抗体，正在转移性或不可切除的恶性实体瘤患者进行临床试验。Aptevo正在开发靶向4-BB和5T4的双特异性抗体候选产品ALG.APV-。
观之国内，也有部分4-BB抗体领先企业，并且关于4-BB药物的研究也越来越多。年，天演药业的针对4-BB靶点的激动型全人源单克隆抗体ADG06已在中美同时获得临床试验批件，开展I期临床。年0月23日，无锡智康弘义申报临床的4-BB抗体WBP获得NMPA受理，成为国内第二家申报该靶点抗体的公司。0年4月6日，上海怀越生物4-BB抗体药物PE06的临床试验申请获得NMPA受理，受理号为CXSL，成为国内第三款申报临床的国产4-BB抗体。
另外，国内也有部分公司在布局PD-L/4-BB双抗，如科望生物从Inhibrx公司引进的ES0、基石药业从瑞士公司Numab引进的ND02、以及洛启生物的纳米双抗。年，科望生物的双特异性抗体ES0获得中国和美国药监部门的临床试验许可，将在中美同时开展临床试验。ES0是一个全球首创、四价双特异性抗体，它同时靶向PD-L及4-BB。基石药业从Numab获得的ND02，是一种针对PD-L、4-BB和人血清蛋白(HSA）的单价三特异性抗体片断分子。洛启生物的纳米双抗靶向PD-L和4-BB。
展望
检查点阻断免疫疗法在多种肿瘤适应症的临床应用中也带来了显著的变化，是治疗多种癌症的有效方法。最著名的用于癌症免疫治疗的抗体是抗CTLA4和PD-抗体。这些免疫疗法在癌症治疗中的重要成果之一是年诺贝尔医学奖，该奖授予JamesAllison和TasukuHonjo教授，他们是发现“检查点”蛋白CTLA-4和PD-的先驱。抗4-BB与CTLA4或/和PD-抗体在多种癌症类型中的协同抗癌作用，为将抗4-BB抗体应用于免疫检查点治疗以提高癌症治疗水平提供了很好的方向。因此，需要进一步研究抗4-BB抗体和其他抗肿瘤抗体或试剂的联合作用机制。此外，我们还需要进一步研究免疫检查点抑制剂在不同癌症分期和不同类型肿瘤治疗中的应用变化。
参考文献：
.AnUpdateonAnti-CD37AntibodiesinImmunotherapiesforCancer.IntJMolSci.Apr;20(8):.2.各公司